寨卡病毒IgM抗体ELISA  96T/盒

                                             样本：(血清和血浆)

（本司同时提供登革热/基肯孔热/疟原虫/黑热病/锥虫/西尼罗河/乙脑/恙虫/立次克体/莱姆/无形体等试剂盒 详情：13802525278 杨先生）

- 仅用于“体外”诊断

A.使用

酶免疫测定（ELISA），用于定量测定人血浆和血清中的寨卡病毒（ZIKA）的IgM抗体。仅用于“体外”诊断。

B.引言

寨卡病毒属于黄病毒科和黄病毒属，因此与登革热，黄热病，日本脑炎和西尼罗病毒有关。像其他黄病毒一样，寨卡病毒是包膜和二十面体的，并且具有非分段的单链，正义RNA基因组。RNA基因组基因编码非结构蛋白和结构蛋白，其*免疫原性的是NS1和ENV抗原。结构蛋白封装病毒。有两个寨卡病毒谱系：非洲谱系和亚洲谱系。系统发育研究表明，在美洲的病毒传播与亚洲菌株密切相关，在2013年爆发期间在法属波利尼西亚传播。

寨卡病毒通过白天活跃的蚊子作为其载体传播。它主要由雌性埃及伊蚊传播以产卵，但是已经从伊蚊属中的许多树木类蚊子中分离出来，在蚊子中具有约10天的外部潜伏期。

自2015年以来，新闻报导提请注意Zika在拉丁美洲和加勒比地区的传播。

2015年，在其胎儿有小头症的两名孕妇的羊水中检测到寨卡病毒RNA，表明病毒已经越过胎盘，可能造成母婴感染。

根据世卫组织2016年2月5日，寨卡病毒和小头症之间的因果关系“被强烈怀疑但尚未科学证明”和“尽管巴西的小头症病例与寨卡爆发有时空相关性，更强有力的调查和需要进行研究以更好地理解这种潜在的联系。

新的建议包括向没有Zika发烧症状的孕妇提供血清学测试，这些症状在过去2-12周内从正在进行的寨卡病毒传播的地区返回;对于没有寨卡症状的孕妇，他们建议在孕期第五个月开始进行产前保健和随访测试。

C.测试原理

微板用与其它黄病毒显示最小交叉反应性的Zika病毒NS1合成抗原包被。

在第一次孵育中，用稀释的样品处理固相，并且抗原捕获抗ZIKV IgM（如果存在的话）。在洗掉样品的所有其它组分后，在第二孵育中，通过加入用过氧化物酶（HRP）标记的抗hIgM抗体来检测结合的抗ZIKV IgM。在固相上捕获的作用于底物/色原混合物上的酶产生与样品中存在的抗ZIKV IgM抗体的量成比例的光学信号。

在测定中进行IgG抗ZIKV的中和，直接在孔中进行，以在IgM的测定中阻断由于这类抗体的干扰。

D.组件

每个试剂盒包含足够的试剂进行96次测试。

微孔板：MICROPLATE

12条×8个用ZIKV特异性合成NS1抗原包被的微孔。将板密封到具有干燥剂的袋中。

2.负控制控制 -

1x2.0ml /瓶。准备使用控制。其含有1％山羊血清蛋白，10mM柠檬酸盐缓冲液pH 6.0 +/- 0.1,0.5％吐温20,0.09％迭氮化钠和0.1％Kathon GC作为防腐剂。阴性对照是黄色编码的。

正控制CONTROL +

1x2.0ml /瓶。准备使用控制。其含有1％山羊血清蛋白，灭活的人抗ZIKV IgM，10mM柠檬酸盐缓冲液pH6.0 +/- 0.1,0.5％吐温20,0.09％迭氮化钠和0.1％Kathon GC作为防腐剂。

阳性对照是深绿色编码。

4.洗涤缓冲液浓缩液：WASHBUF 20X

1x60ml /瓶20x浓缩溶液。一旦稀释，洗涤溶液含有10mM磷酸盐缓冲液pH 7.0 +/- 0.2,0.05％Tween 20和0.05％Kathon GC。

酶联液：CONJ

1x16ml /瓶。准备使用和红色编码。其含有针对人IgM，5％BSA，10mM Tris缓冲液pH 6.8 +/- 0.1,0.1％Kathon GC和0.02％硫酸庆大霉素的辣根过氧化物酶缀合的多克隆抗体作为防腐剂。

6.色原/基质：SUBS TMB

1x16ml /瓶。其含有50mM柠檬酸盐 - 磷酸盐缓冲液pH 3.5-3.8,4％二甲基亚砜，0.03％四甲基联苯胺（或TMB）和0.02％过氧化氢（或H 2 O 2）。

注意：要防止光存储，对强烈的照明敏感。

7.硫酸：H 2 SO 4 0.3M

1×15ml /瓶含有0.3M H 2 SO 4溶液。

注意：刺激性（H315，H319; P280，P302 + P352，P332 + P313，P305 + P351 + P338，P337 + P313，P362 + P363）。

8.标本稀释液：DILSPE

2x60ml /瓶。其含有2％酪蛋白，10mM柠檬酸盐缓冲液pH 6.0 +/- 0.1,0.2％吐温20,0.09％迭氮化钠和0.1％Kathon GC作为防腐剂。用于稀释样品。

9.中和试剂：SOLN NEUT

1x8ml /瓶。其含有山羊抗hIgG，2％酪蛋白，10mM柠檬酸盐缓冲液pH 6.0 +/- 0.1,0.09％迭氮化钠和0.1％Kathon GC作为防腐剂。

10.板密封箔n°2

11.包装插入n°1

E.材料需要但不提供

1.校准微量移液器（1000,100和10ul）和一次性塑料吸头。

2. EIA级水（双蒸馏水或去离子水，经处理以除去用作消毒剂的氧化性化学品的木炭）。

3.定时器有60分钟或更高的范围。

4.吸收纸巾。

5.校准的ELISA微孔板恒温培养箱（干或湿）设置在+ 37℃（+/- 0.5℃公差）。

6.校准的ELISA微孔读数器，具有450nm（读数）和620-630nm（消隐）滤器。

7.校准的ELISA微孔板洗涤器。

8.涡流或类似的混合工具。

F.警告和注意事项

1.只有在负责实验室的医生的监督下，才能由经过专门培训的技术人员使用该试剂盒。

2.参与实验的所有人员必须佩戴防护实验服，不含滑石的手套和眼镜。应避免使用任何尖锐（针）或切割（刀片）设备。根据美国亚特兰大疾病控制中心的建议，所有参与的人员应接受生物安全程序的培训，并在国家卫生研究所的出版物“生物安全微生物和生物医学实验室” 1984年。

3.所有参与样品处理的人员都应接种HBV和HAV疫苗，为疫苗提供安全和有效的疫苗。

4.在打开试剂盒和微量培养板以及进行试验时，应控制实验室环境，以避免污染物，如灰尘或空气中的微生物制剂。保护色原/基板（或TMB）免受强光照射，避免进行测试的台面振动。

5.收到后，将套件在2..8°C下存放在温度控制的冰箱或冷藏室中。

6.不要在不同批次的试剂盒之间交换组件。建议同一批次的两个套件之间的组件不应互换。

7.检查试剂是否清澈，不含可见的重颗粒或聚集物。如果没有，建议实验室主管启动套件更换的必要程序。

8.使用一次性吸头避免血清/血浆样品之间的交叉污染，并在每个样品后更换。

9.通过使用一次性吸头并在每次使用之间更换它们，避免试剂盒试剂之间的交叉污染。

10.不要在外部容器和内部（小瓶）标签上规定的有效期后使用试剂盒。对已打开的试剂盒进行的研究没有指出任何相关的活性损失，多达6次使用该装置和长达6个月。

11.将所有标本视为潜在感染性。所有人血清标本应按照美国亚特兰大疾病控制中心的建议，按照健康研究所出版物“微生物和生物实验室生物安全”（Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories）中所述，在生物安全2级处理。 1984年。

12.在制备液体组分或将组分转移到自动化工作站时，建议使用一次性塑料制品，以避免交叉污染。

13.在使用试剂盒期间产生的废物必须按照关于化学和生物物质的实验室废物的国家指令和法律进行废弃。特别地，从洗涤过程产生的液体废物，来自对照/校准物的残余物和来自样品的液体废物必须作为潜在感染性物质处理并在废物之前失活。建议的灭活方法是用10％最终浓度的家用漂白剂处理16-18小时或者通过在121℃下高压灭菌20分钟进行热灭活。

14.样品和操作的意外泄漏必须用浸有家用漂白剂，然后用水浸湿的纸巾吸附。然后应将组织丢弃在指定用于实验室/医院废物的适当容器中。

15.硫酸是刺激剂。如发生溢出，用大量水冲洗表面。

16.使用试剂盒产生的其他废物（例如：用于样品和对照品/校准品的提示，用过的微量培养板）应作为潜在的传染性物质处理，并根据国家有关实验室废物的指令和法律处理。

G.样品：准备和警告

1.通过静脉穿刺无菌抽取血液，并使用用于临床实验室分析的样品制备的标准技术制备血浆或血清。在用柠檬酸盐，EDTA和肝素制备样品中没有观察到影响。

2.样品必须用代码或名称清楚标识，以避免误解结果。强烈建议使用条形码卷标和电子阅读。

3.溶血（“红色”）和明显高脂血症（“乳白色”）样品必须丢弃，因为它们可能产生错误结果。含有纤维蛋白或重颗粒或微生物细丝和体的残留物的样品应被丢弃，因为它们可能导致错误的结果。

血清和血浆可以在收集后在+ 2°.8°C储存长达五天。对于较长的储存期，样品可以在-20℃冷冻储存几个月。任何冷冻样品不应多次冷冻/解冻，因为这可能产生可能影响测试结果的颗粒。

5.如果存在颗粒，则以2.000rpm离心20分钟或使用0.2-0.8u过滤器过滤以清洁样品用于测试。

H.组件和警告的准备

微孔板：

使微孔板在打开容器之前达到室温（约1小时）。检查干燥剂是否未变成深绿色，表明存储有缺陷。

在这种情况下，致电Dia.Pro的客户服务。

未使用的条必须放回铝袋中，在干燥剂的存在下，牢固地压缩并储存在+ 2°.8°C。当第一次打开时，残留的条带是稳定的，直到干燥剂袋内的湿度指示器从黄色变为绿色。

质控：

准备使用组件。使用前在涡流小心混合。不要稀释！

洗涤缓冲液：

浓缩溶液的全部内容物必须用双重蒸馏水稀释20倍，并在使用前轻轻地颠倒混合。在制备过程中避免起泡，因为气泡的存在会影响洗涤循环的效率。

注意：稀释后，洗涤溶液在+ 2..8℃下稳定1周

酶联液：

可以使用。使用前在涡流上充分混合。

小心不要用氧化性化学品，空气驱动的灰尘或微生物污染液体。

如果该组分必须转移，则仅使用塑料，可能是无菌的一次性容器。

色原/底物：

可以使用。使用前在涡流上充分混合。

小心不要用氧化性化学品，空气驱动的灰尘或微生物污染液体。

不要暴露在强烈的照明，氧化剂和金属表面。

如果该部件必须转移，只使用塑料，可能无菌的一次性容器

样品稀释剂

准备使用组件。使用前在涡流小心混合。

中和试剂

准备使用组件。使用前在涡流小心混合。

硫酸：

可以使用。使用前在涡流上充分混合。

注意：刺激性（H315，H319; P280，P302 + P352，P332 + P313，P305 + P351 + P338，P337 + P313，P362 + P363）。

警告H语句：

H315 - 造成皮肤刺激。

H319 - 造成严重眼刺激。

防范语句：

P280 - 戴防护手套/穿防护服/戴防护眼罩/戴防护面具。

P302 + P352 - 如果皮肤接触：用大量肥皂和水清洗。

P332 + P313 - 如果发生皮肤刺激：求医/就诊。

P305 + P351 + P338 - 如进入眼睛：用水小心冲洗几分钟。取出隐形眼镜，如果有，容易做。继续冲洗。

P337 + P313 - 如果眼睛刺激持续：求医/就诊。

P362 + P363 - 脱掉沾污的衣服，清洗后方可重新使用。

I.与工具箱组合使用的仪器和工具

1.微量移液器必须进行校准，以提供测定所需的正确体积，并且必须对那些可能偶然与样品接触的部分进行定期去污（家用酒精，漂白剂，医院级消毒剂的10％溶液）。它们还应当定期维护，以便显示1％的精度和+/- 2％的真实性。还应定期对工具箱部件的溢出物或残留物进行去污。

2. ELISA孵化器必须设置在+ 37°C（允许+/- 0.5°C），并定期检查以确保保持正确的温度。干燥培养箱和水浴适用于孵育，条件是该仪器经过验证用于ELISA测试的孵育。

3. ELISA洗涤器对测定的整体性能非常重要。在使用该套件进行常规实验室测试之前，必须使用套件控制/校准器和参考面板对洗衣机进行仔细验证和正确优化。通常4-5次洗涤循环（吸出+ 350ul /孔的洗涤溶液的分配= 1个循环）足以确保测定如预期那样进行。建议在循环之间保持20-30秒的浸泡时间。为了正确设置它们的数量，建议使用试剂盒对照/校准器和良好表征的阴性和阳性参照样品进行测定，并检查以匹配以下“内部质量控制”部分中报告的值。必须根据制造商的说明对洗衣机的交付量和维护（针的净化和清洁）进行定期校准。

4.孵育时间具有+ 5％的公差。

5.酶联免疫吸附测定酶标仪必须配备450nm的读取滤光片，并配备第二个滤光片（强烈建议使用620-630nm）进行消隐。其标准性能应为（a）带宽<10 nm; （b）0至> 2.0的吸亮度范围; （c）线性至> 2.0;重复性> 1％。在“测定程序”部分中鉴定的孔上进行消隐。必须定期校准读取器的光学系统，以确保测量正确的光密度。应根据制造商的说明定期维护。

6.当使用ELISA自动工作站时，必须仔细设置，校准，控制和定期维护所有关键步骤（分配，孵育，洗涤，读数，数据处理），以符合“内部质量控制“。测定方案必须安装在设备的操作系统中，并且对于洗衣机和阅读器进行验证。此外，站的液体处理部分（分配和清洗）必须被验证和正确设置。必须特别注意避免用于分配和用于洗涤的针所带走。这必须研究和控制，以最小化相邻井的污染的可能性。当待测样品数量超过20-30个单位时，推荐使用ELISA自动工作站。

7. Dia.Pro的客户服务为用户提供设置和检查与套件结合使用的仪器的支持，以确保符合所述要求。还支持安装与套件一起使用的新仪器。

L.前期分析控制和操作

1.检查打印在外部标签（主容器）上的套件的到期日期。如果过期，请勿使用。

2.检查液体组分是否没有被可见的颗粒或聚集物污染。

3.用无菌塑料移液管吸取少量体积，检查色原/底物是无色还是浅蓝色。

4.检查运输过程中是否有破损，箱体（主容器）内是否有溢出液体。检查包含微孔板的铝袋是否有刺孔或损坏。

5.如上所述稀释20倍浓缩洗涤溶液的所有内容物。

6.让所有其他组分达到室温（约1小时），然后在涡旋所有液体试剂上轻轻混合。

7.将ELISA孵育器置于+ 37℃，并根据制造商的说明通过用稀释的洗涤溶液预处理来制备ELISA洗涤剂。设置正确的洗涤循环次数，在仪器的验证中发现，与试剂盒一起使用。

8.检查ELISA读数器是否打开，或确保在读数前至少20分钟打开。

9.如果使用自动工作站，请打开，检查设置，并确保使用正确的测定方案。

10.检查微量移液器是否设置为所需的体积。

11.检查所有其他设备是否可用并准备就绪。

12.如果出现问题，请不要继续进行测试，并通知主管。

M.测定程序

该测定必须根据以下报导进行，注意在测试中保持所有样品的相同温育时间。

1.将所需数量的条带放入塑料支架中，仔细识别校准品和样品的孔。

2.稀释样品1：101分配1ml样品稀释剂到一次性管中，然后10μl样品; 使用前在涡流上混合。不要稀释控制器，因为它们是即用型。

3.将A1留空以便进行消隐。

4.在除了A1孔之外的所有孔中分配50μl中和试剂，用于空白操作。

在识别的位置移液器100微升的阴性对照一式三份，100微升的阳性对照单一，然后100微升的稀释样品。

6.在+ 37℃下孵育微板60分钟。

重要说明：条带必须用粘合密封箔密封，只有当手动进行测试时。使用ELISA自动仪器时，请勿覆盖条。

7.当第一次孵育完成后，如前所述（第I.3节）洗涤微孔，

8.在所有的孔，除了A1，移液器100微升酶结合物。在+ 37°C孵育微孔板60分钟。

重要提示：小心不要触及孔的塑料内表面，使其*充满酶偶联物。可能发生污染。

9.当第二次孵育完成后，如前所述（第I.3节）洗涤微孔，

10.吸取100μl色原/底物到所有孔中，包括A1。

重要提示：不要暴露在强直射光下。因为可能生成高背景。

11.在室温（18-24℃）下孵育保护的微孔板20分钟。分配阳性样品的孔和阳性校准品将从透明变为蓝色。

12.使用与步骤10相同的移液序列，将100μl硫酸移至所有孔中以阻断酶反应。添加终止溶液将使阳性校准物和阳性样品从蓝色变为黄色。

13.使用450nm滤光片（读数）和620-630nm滤光片（背景扣除，强烈推荐），如在部分I.5中所述，测量每个孔中溶液的颜色强度，将仪器在A1或B1或两者上。

一般重要说明：

1.如果第二个过滤器不可用，请确保在450nm读数之前，在微孔底部不存在指纹。指纹可能在阅读时产生假阳性结果。

2.在添加停止溶液之后必须进行读数，并且添加后不超过20分钟。可能发生色原体的一些自氧化，导致高背景。

3.原则上的任何阳性结果应通过替代血清学方法（例如：IFA）来确认。

4.当测试结果从实验室传送到信息中心时，必须注意避免错误的数据传送。

5.必须由合格的医生完成Zika病毒感染的诊断并将其释放给患者，并用另一种方法（例如：Zika病毒RNA的PCR）确认事件。

N.测定方案

O.内部质量控制

在使用试剂盒的任何时间进行验证检查，以验证测定的性能是否合格。

控制以下数据匹配：

如果测试结果符合上述要求，则进行下一节。

如果没有，请不要继续操作，并执行以下检查：

P.结果

测试结果通过利用下式根据阴性对照（NC）的平均OD 450nm值确定的截止值来计算：

NC + 0.250 = Cut-Off (Co)

阴性质控 + 0.25 = 截止值 (Co)

为测试找到的值用于解释结果，如下一段所述

重要的提示：

当结果的计算由ELISA自动化工作站的操作系统执行时，确保使用适当的公式来产生正确的结果解释。

问：结果的解释

测试结果被解释为样品OD 450nm值（S）和截止值（Co）或S / Co的比率，根据下表：

阴性结果表明患者尚未发展针对ZIKA的IgM抗体。

阳性结果指示正在进行的ZIKA感染。

R.性能特性

已经在临床外部中心和内部对选定的组进行了性能评价。

1.检测限制

迄今为止，欧洲共同体没有定义ZIKV IgM抗体检测的国际标准。

在缺乏时，已经定义了源自具有慢性ZIKV感染史的患者的内部黄金标准（或IGS），以便为装置提供恒定的和优异的灵敏度。

2.灵敏度和特异性：

在外部临床中心进行的研究中评价该性能，在感染性疾病和ZIKV的诊断方面具有极好的经验。

所有样品ZIKV PCR +检测阳性。

在来自正常个体和献血者的超过400个阴性样品的组上确定特异性。

还检查了一组潜在干扰样品（RF +，hemolised，lipemic等）。在检查的样品上没有观察到干扰。

用不同标准制备技术（柠檬酸盐，EDTA和肝素）衍生的血浆和血清已被用于测定特异性。没有观察到由于样品制备方法的假反应性。

冷冻样品也已经过测试，以检查样品冻结是否干扰测试的性能。在清洁和无颗粒样品上未观察到干扰。

性能评估提供了以下值：

在来自其他黄病毒和基孔肯尼亚病毒的感染的样品组中观察到一些交叉反应。

3.重现性：

它已经在不同运行中重复检测的两个样品上计算。结果报告如下，总结在表中：

S.限制

假阳性已经在少于2％的正常人群中评估，主要是由于高滴度的RF。

含有纤维蛋白颗粒或聚集体的冷冻样品可能产生假阳性结果。

观察到与其他黄病毒和基孔肯尼亚病毒的交叉反应。

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